Синтетичний організм. ТЮБ 2016

10. Синтетичний організм. Уявіть, що Ви — провідний спеціаліст у галузі синтетичної біології й очолюєте проект щодо створення першого у світі штучного живого організму. Опишіть, які експерименти Ви будете проводити і які труднощі у Вас виникатимуть на шляху реалізації проекту.

Синтетична біологія – нова галузь дослідження, яка об'єднує науку та інженерію з метою проектування та побудови нових біологічних функцій і систем.

Лавиноподібне збільшення кількості організмів, геном яких був прочитаний, породило проблему розуміння біологічної ролі кожного гена в організмі. До останнього часу було не зрозуміло, чи містить геном повну інформацію про будову організму, і чи буде життєздатний організм з хімічно синтезованим геномом?

Саме це і спробувала з'ясувати наша дослідницька група.

Спершу постало питання вибору організму, який має бути штучно синтезований. Ми зупинились на найпростіше організованих, а саме вірусах. Першим успіхом в цьому напрямку став синтез геному бактеріофага φX174. Але, оскільки віруси вважаються живими організмами досить умовно, то ми вирішили спробувати синтезувати і трансплантувати в клітину-реципієнт геном організму, здатного і до самостійного існування. Свій вибір ми зупинили на бактеріях з найменшим геномом – мікоплазмах, хоча і вони є паразитами, але здатні вільно жити на поживних середовищах.

Першою частиною роботи стало кількаразове секвенування генома Mycoplasma genitalium підвиду G37 (зразок MG408), патогенна активність якої була блокована спеціальним маркером. Такі повторні експерименти дозволяють виявити і виправити помилки, неминуче присутні при одноразовому "прочитанні".

Молекули ДНК завдовжки в кілька тисяч пар нуклеотидів сьогодні виготовляються на замовлення біотехнологічними фірмами, як в чистому вигляді, так і у вигляді плазміди, вставленої в живу кишкову паличку. Але синтезувати за раз дуже довгі послідовності вчені поки не вміють: коли ланцюг ДНК доростає до декількох сотень тисяч нуклеотидів, він починає плутатися і рватися.

Тому була розроблена технологія синтезу геному частинами – «касетами». Спочатку весь геном моделювався на комп'ютері, де в міжгенних областях, толерантних до транспозиції, фрагменти ДНК ієрархічно збиралися у все більш крупні частини. Таким чином, на першому етапі збиралися ділянки ДНК («касети») довжиною по кілька тисяч пар нуклеотидів  з послідовностями, що перекриваються, для з'єднання один з одним (остання касета повністю перекривається з першою для замикання в кільце – типову форму існування ДНК в бактеріальних клітинах).

Перша спроба створення штучного геному полягала в синтезі хромосоми M. genitalium довжиною 582 970 пар. Касети, що перекриваються, були зібрані з хімічно синтезованих полінуклеотидів. Повна збірка геному з чотирьох складових здійснена рекомбінацією в клітині дріжджів. Секвенування отриманої хромосоми підтвердило точність синтезу. Для ідентифікації штучного генома в ДНК були включені нуклеотидні послідовності, так звані «водяні знаки».

У подальших експериментах від бактерій M. genitalium як генетичного прототипу довелося відмовитися через характерну для них надзвичайно низьку швидкість росту. У наступних дослідженнях в якості прототипу використовувався геном Mycoplasma mycoides підвиду capri (GM12) розміром 1,08 млн нуклеотидних пар, а в якості реципієнта – Mycoplasma capricolum підвиду capricolum (CK).

Для роботи були використані два генома: CP001621 і трансгенний геном CP001668.

Використовуючи отриману і вивірену послідовність ДНК M. mycoides як зразок, почали хімічно синтезувати геном цієї бактерії з окремих нуклеотидів, створених промисловим способом.

Як пристрої для збирання касет вчені використовували живі клітини – їхні ферментативні системи "склеюють" фрагменти ДНК з такою точністю, якої неможливо досягти при хімічному сполученні "Склейку" проводили в три етапи: спочатку поєднували касети по тисячі нуклеотидів і отримували фрагменти довжиною в 10 тисяч "букв". Потім ці "заготовки" з'єднували один з одним, щоб отримати фрагменти в 100 тисяч нуклеотидів, які, нарешті, об'єднували в цілий геном. Всі ці операції проводили спочатку в клітинах кишкової палички, потім, коли генетичний напівфабрикат доріс до сотень тисяч нуклеотидів, в клітинах дріжджів.

Таким чином, на базі зразка CP001621 були синтезовані касети, використані для подальшого синтезу. Після закінчення секвенування зразка CP001668 була проведена звірка, що виявила відмінності в 95 фрагментах. Відмінності, визнані біологічно значущими, були скориговані в уже синтезованих касетах. 19 відмінностей, які не впливають на життєдіяльність бактерії, залишені без змін. У чотирьох областях генома, які не є життєво важливими, сформовані 4 мітки WM1-WM4 довжиною 1246, 1081, 1109 і тисячу двісті двадцять два пар відповідно. Синтезований таким чином геном Mycoplasma mycoides був успішно трансплантований в клітину-реципієнт M. capricolum з отриманням життєздатної бактерії. Незважаючи на природне походження плазматичної мембрани і цитоплазми, такі бактерії виявляли фенотипові ознаки клітин M. mycoides. Отримана генна послідовність M. mycoides JCVI syn1.0 була занесена в базу GenBank під кодом CP002027.

Та, перш ніж це стало можливим, вченим довелося подолати чимало технічних труднощів, перш ніж вони змогли виготовити синтетичний геном M. genitalium, а потім і вдвічі більший геном M. mycoides. Окрім зазначених вище проблем, наприклад, перші спроби перенесення хромосоми M. mycoides в клітину M. сapricolum закінчилися невдачею. Як з'ясувалося, причина полягала в системі рестрикції бактеріальних клітин. ДНК, клонована в дріжджах, не метильована і при перенесенні в M. сapricolum піддається знищенню з боку системи рестрикції. Також були труднощі у відокремлені виділених з дріжджів синтетичних бактеріальних хромосом від ДНК самих дріжджів.

Окрім технічних питань, були ще й фінансові, а також етичні, релігійні й навіть філософські.

Та не зважаючи на всі перешкоди і труднощі, даний експеримент показує функціональну релевантність штучної хромосоми і процес переходу від «програми» до її «реалізації». Зібраний з хімічно синтезованих фрагментів ДНК геном взяв під контроль живі бактеріальні клітини, в які його трансплантували, після чого всі їхні властивості стали відповідати вміщеній в ньому «інструкції». Це досягнення, на яке було витрачено 40 млн доларів і 15 років роботи, дозволяє сподіватися, що не за горами створення мікробів з потрібними людині властивостями.